Moving genomsnittet imagej

Image Intensity Processing Ljusstyrka är den visuella uppfattningen av reflekterat ljus. Ökad ljusstyrka hänför sig till en bild ökad luminans. Kontrast är åtskillnaden mellan de ljusaste och mörkaste delarna av en bild. En ökning i kontrast kommer att mörka skuggor och lätta höjdpunkter. Ökande kontrast används vanligtvis för att göra objekt i en bild mer distinkt. Justera ljusstyrkan och kontrast med bildjustering BrightnessContrast. för att göra visualisering av bilden lättare. Tryck på Auto-knappen för att applicera en intelligent kontraststräcka på bildskärmen. Ljusstyrka och kontrast justeras med hänsyn till bildhistogrammet. Om du trycker upprepade gånger ökar knappen procentandelen mättade pixlar. Återställningsknappen gör max 0 och minst 255 i 8-bitars bilder och maximalt och minimalt lika med de minsta och största pixelvärdena i bildhistogrammet för 16-bitars bilder. Om den automatiska knappen inte ger ett önskvärt resultat, använd verktyget region av intresse (ROI) för att välja en del av cellen och någon bakgrund och tryck sedan på knappen Auto igen. Sträckan kommer då att baseras på ROI-intensiteten. Genom att trycka på Apply-knappen ändras de faktiska gråvärdena för bilden permanent. Om du bara analyserar bildintensiteten trycker du inte på den här knappen. Om du föredrar att bilden ska visas som svart till vitt snarare än vitt på svart, använd sedan inverterat kommando: Image Lookup Tables Invert LUT. Kommandot Edit Invert inverterar pixelvärdena själva permanent. Få intensitetsvärden från en enskild ROI Om du arbetar med en stapel kan den markerade avkastningen analyseras med kommandot: Bildstaplar Plot Z Axis Profile. Detta genererar en enda kolumn med siffror - en skivintensitet per rad. Kolumnens 6 främsta rader är detaljer om avkastningen. Detta gör att samma avkastning inte analyseras två gånger och låter dig spara några intressanta avkastningar. Detaljerna består av område, x-koordinat, y-koordinat, AR, rundhet och soliditet i avkastningen. Om avkastningen är ett ROI-värde i stället för en squaregtoval, verkar det som om avkastningen är en ovaltsquare. Den (ovala) avkastningen kan återställas genom att ange detaljerna som uppmanas av kommandot Edit Selection Restore Selection (snabbtangent: Ctrl Shift E). Resultaten visas i ett tomtfönster med ROI-detaljerna i plottfönsterets titel. Plot innehåller knapparna Lista, Spara, Kopiera. Kopiera knappen sätter data i klippbordet så att det kan klistras in i ett Excel-ark. Inställningarna för kopieringsknappen finns under Redigera alternativ Profil Plot Options. Rekommenderade inställningar inkluderar: Spara inte x-värden (förhindrar skivnummerdata som klistras in i Excel) och Autoclose så att du inte behöver stänga det analyserade diagrammet varje gång. Dynamisk intensitet vs Tidsanalys Plugin Plot Z Axis Profile (det här är Z Profiler från Kevin (Gali) Baler (Gliblr at Yahoo) och Wayne Rasband omdirigeras helt enkelt) kommer att övervaka intensiteten av en rörlig avkastning med hjälp av ett partikelspårningsverktyg. Detta verktyg kan vara antingen manuellt eller automatiskt. Använd kommandot Image Stacks Plot Z Axis Profile. Få intensitetsvärden från flera ROI Du kan analysera flera avkastningar på en gång med Bob Doughertys Multi Measure plugin. Den inbyggda ROI-managerfunktionen gör ett liknande jobb, men genererar inte resultaten i sorterade kolumner. Kolla Bobs webbplats för uppdateringar. Multi-plugin som följer med installationen är v3.2. Öppna konfokalserier och ta bort bakgrunden (Se Bakgrundskorrigering) Generera en referensstapel för tillägg av avkastning. Använd funktionen Image Stacks Z-project och välj medelvärdet. Byt namn på den här bilden något minnesvärt. Öppna plugin för ROI Manager (Analysera Verktyg Roi Manager eller verktygsfält ikon). Välj ROI och Lägg till i ROI-hanteraren. Klicka på Visa alla-knappen för att undvika att analysera samma cell två gånger. Efter att ha valt ROI som ska analyseras i referensbilden kan du rita dem till referensbilden genom att klicka på Moregtgt-knappen och välja Draw. Spara referensbilden till experimentdatamappen och klicka sedan på stapeln som ska analyseras. Klicka på knappen Moregtgt i ROI-hanteraren och välj Multi Measure-knappen för att mäta alla ROI. Klicka på Ok. Detta lägger värden från varje segment till en enda rad med flera kolumner per skiva. Genom att klicka på Mät alla 50 skivor läggs alla värden från alla skivor och varje avkastning i en enda kolumn. Gå till fönstret Resultat och välj menyalternativet Edit Select All. . Då EditCopy. Gå till Excel och klistra in i data. Kontrollera att allt har klistras in korrekt. 10. För att kopiera ROI-koordinater till Excel-kalkylbladet behöver det finnas en tom rad över intensitetsdata. Använd dialogrutan Multi Measurement och klicka på knappen Kopiera listan. 14. I Excel, klicka på den tomma cellen ovanför den första datakolonnen och klistra in i ROI-koordinaterna. Spara avkastningen med multimåttknappen Spara. Lägg dem i den experimentella datamappen. ROI: erna kan öppnas senare antingen individuellt med knappen Öppna eller allt på en gång med knappen Öppna alla. Ovala och rektangulära ROI kan återställas individuellt från x, y, l, h-värdena med plugin ROI Specify ROI. kommando. Ratiometrisk bildbehandling jämför uppspelningen av två olika signaler för att se om det finns några likheter mellan dem. Det görs genom att dela en kanal med en annan kanal för att producera en tredje ratiometrisk kanal. Denna teknik är användbar eftersom den korrigerar för färgläckage, ojämn färgämnesbelastning och bildblekning. Ett exempel på applikation skulle mäta intracellulär jon, pH och spänningsdynamik i realtid. Bakgrundssubtraktion behövs innan analys av bilder med dubbla kanalförhållanden. Se även bakgrundskorrigeringsavsnittet. Plugin RatioProfiler kommer att utföra ratiometrisk analys av en enda ROI på en dubbelkanal mellanliggande stapel. De udda skivorna är kanal 1 bilder och de jämn skivorna är kanal 2 bilder. Om dina två kanaler öppnas som separata staplar, som Zeiss, kan de två kanalerna interfolieras (blandas genom att växla mellan dem) med menykommandon Plugins Stacks - Shuffling Stack Interleaver. Pluggen kommer att generera en grön plot av förhållandevärdena. Ch1Ch2 är standard och du kan få Ch2Ch1 om plugin körs med Alt-tangenten neråt. Det kommer även att generera en andra plot av intensiteten hos de enskilda kanalerna, Ch1 och Ch2, samt en resultattabell. Den första raden i resultattabellen innehåller värden för räntan x, y, bredd och höjd. Från den andra raden nedåt är den första kolumnen tiden (skivnummer), den andra kolumnen är Ch1-medelintensiteten och den tredje kanalen är Ch2-medelintensiteten och förhållandevärdet. Stacken måste ha sitt ramintervall kalibrerat för att Time-värdet ska vara i sekunder. Annars är det skivor. Ramintervallet kan ställas in för stapeln via menykommandot Bildegenskaper. Denna tabell kan kopieras till urklippet och klistras på annat håll med menyn Edit Edit All. Ratio Analys Använda ROI-hanterare 1.Trakt bakgrunden från bilden. 2. Öppna ROI-hanteraren (Analysera Verktygs ROI-hanterare.) Och klicka på Visa alla-knappen. 3. Välj de celler som ska analyseras och lägg till dem i ROI-hanteraren (Lägg till knapp eller tangentbord T-tangenten). 4. Kör plugin. Resultatfönstret innehåller medelvärdet av ch1 och ch2 och deras förhållande. Varje rad är en tidpunkt (skiva). Den första raden innehåller ROI-detaljerna. För att generera en referensbild: Placera stapeln med menykommandot (Bildstaplar Z-projekt med Projektionstyp: Maximal), Justera ljusstyrka och kontrast om det behövs. Markera den nya bilden och klicka på knappen Mer i avkastningshanteraren. Välj sedan Etikett. Hämta tidsstämpeldata LSM Verktygslåda är ett projekt som syftar till att integrera gemensamma användbara funktioner runt Zeiss LSM-filformat, vilket skulle förbättra användbarheten hos konfokala LSM-filer som behålls i sitt ursprungliga format och därmed bevara all tillgänglig metadata. I Fiji är motsvarande kommandon: Fil Importera Visa LSMToolbox som visar verktygslådan, från vilken alla kommandon kan ringas och Hjälp Om Plugins LSMToolbox. som visar information om plugin. Denna läsning kan hittas genom att använda menykommandot Bildvisningsinfo. . Bläddra ner för att få den tid varje skiva förvärvades. Markera den här tiden, kopiera den till Excel och hitta det tidsnummer som erhållits genom att använda Excel-menykommandot Redigera Byt ut. Detta lämnar endast tidsdata. Den förflutna tiden kan sedan beräknas genom att subtrahera rad 1 från alla efterföljande rader. Linescanning innebär att man får en enda linje, en pixel i bredd, från ett gemensamt konfokalmikroskop istället för en standard 2D-bild. Det här är oftast ett snabbare sätt att ta en bild. Alla pixel-breda bilderna staplas sedan för att återskapa 2D-bilden. En pseudo-linescan generation av en 3-D (x, y, t) bild. Det är användbart för visning av 3-D-data i 2 dimensioner. En intressant räckvidd ritas följt av kommandot: Bildstacklåsning eller med tangentbordsknappen. Det kommer att fråga dig linjebredden som du vill bli genomsnittlig. Det kommer att generera en pseudo-linescan stack med varje skiva som representerar pseudo-linescan av en enkel pixel bred linje längs linjen av intresse. Medelvärdet pseudo-linescan stack genom att välja Image Stacks Z-Project. och använd kommandot Average. En poly-linje kan användas, men detta kommer endast att generera en enda pixelskiva. Fijis standardinställningar förutsätter att staplar är z-serier snarare än t-serier. Det betyder att många funktioner relaterade till en tredimensionell bildstapel hänvisas till med en z-. Håll bara detta i åtanke. FRAP (Fluorescensåterställning Efter Photobleaching) Analys FRAP-profiler plugin analyserar intensiteten hos en blekt ROI över tiden och normaliserar den mot intensiteten hos hela cellen. Därefter hittar den minsta intensiteten i det blekta avkastningen och passar återhämtningen med detta i åtanke. Öppna ROI-hanteraren. Rita runt det blekta avkastningen och lägg till det i avkastningsinställningen. Rita runt hela cellen och lägg till den till ROI-chefen. Normaliseringen korrigerar för blekning som inträffar under bildförvärv och förutsätter att hela cellen är i synfältet. Plugin antar den större av de två avkastningarna i ROI-hanteraren är hela mobilavkastningen och att den mindre avkastningen är den blekta delen. Kör FRAP profiler plugin. Pluggen kommer att returnera intensiteten mot tidpunkten, normaliserad intensitet vs tidpunkt för det blekta området och kurvanpassningen. Icke-linjär kontraststräckning Equalization Du kan ha mer kontroll över ljusstyrka och kontrastjusteringar med kommandot Förbättra kontrast meny. Med en stapel analyserar den varje skivhistogram för att göra justeringen. Kommandot Equalize contrast använder en icke-linjär sträcka av histogrammet baserat på kvadratroten av dess intensitet. Gamma utför en icke-linjär histogramjustering. Svaga föremål blir mer intensiva medan ljusa objekt inte gör det (gamma lt1). Även objekt med medelintensitet blir svagare medan ljusa objekt inte (gamma gt 1). Intensiteten hos varje pixel höjs till kraften i gammavärdet och sedan skalas till 8 bitar eller min och max 16 bitars bilder. För 8 bitars bilder Ny intensitet 255 (gammal intensitet255) gamma Gamma kan justeras via kommandot Process Math Gamma. Det låter dig justera gamma med rullningsfältet. Klicka på Ok när du är klar. Du kan använda rullningsfältet för att bestämma önskat gammamärke på en skiva av din stapel. Det finns också ett alternativ att förhandsgranska resultaten. Se online-referensen för en förklaring av digitala filter och hur de fungerar. Filter kan hittas med hjälp av menykommandot Processfilters. . Medelfilter. pixeln ersätts med genomsnittet av sig själv och dess grannar inom den angivna radien. Menyalternativet Process Smooth är ett 33 medelfilter. Gaussian filter. Detta liknar ett utjämningsfilter men ersätter istället pixelvärdet med ett värde som är proportionellt mot en normal fördelning av sina grannar. Medianfilter. Pixelvärdet ersätts med medianen av sig själv och dess angränsande grannar. Detta tar bort buller och bevarar gränserna bättre än enkla medelfiltrering. Menyalternativet Process Noise Despeckle är ett 33-medianfilter. Convolve filter: Detta tillåter att två arrayer av tal multipliceras tillsammans. Arrayerna kan vara olika storlekar men måste ha samma dimension. I bildanalys används denna process generellt för att producera en utmatningsbild där pixelvärdena är linjära kombinationer av vissa inmatningsvärden. Minsta: Detta filter, även känt som ett erosionsfilter, är ett morfologiskt filter som betraktar grannskapet kring varje pixel och bestämmer härmed minimivärdet från denna lista över grannar. Varje pixel i bilden ersätts sedan med det resulterande värdet som genereras av varje stadsdel. Maximalt: Detta filter, även känt som ett dilatationsfilter, är ett morfologiskt filter som betraktar grannskapet kring varje pixel och avgör från denna lista av grannar det maximala värdet. Varje pixel i bilden ersätts sedan med det resulterande värdet som genereras av varje stadsdel. Kalman filter. Detta filter, även känt som den linjära kvadratiska uppskattningen, arbetar rekursivt med bullriga ingångar för att beräkna en statistiskt optimal uppskattning av det underliggande systemtillståndet. Bakgrundskorrigering kan göras på flera sätt. En enkel metod är att använda Image Lookup Tables HiLo LUT för att visa nollvärden som blå och vita värden (pixelvärde 255) som röda. Med en bakgrund som är relativt jämn över bilden, ta bort den med kommandot BrightnessContrast genom att långsamt höja minimivärdet tills det mesta av bakgrunden visas blå. Tryck på Apply-knappen för att göra en permanent ändring. Rullande bollens bakgrundskorrigering För att fixa en ojämn bakgrund, använd menykommandot Process Subtraher Background. Detta kommer att använda en rullande bollalgoritm på ojämn bakgrund. Radien bör vara inställd på åtminstone storleken på det största objektet som inte ingår i bakgrunden. Det kan också användas för att ta bort bakgrunden från geler där bakgrunden är vit. Att köra kommandot flera gånger kan ge bättre resultat. Användaren kan välja om den ska ha en ljus bakgrund, skapa en bakgrund utan subtraktion, ha en glidande paraboloid, inaktivera utjämning eller förhandsgranska resultaten. Standardvärdet för rullande bollradie är 50 pixlar. Processen subtraherar Background. Tau Patologi inducerar excitatorisk Neuronförlust, Grid Cell Dysfunktion och Spatialminne Deficits Reminiscent av tidig Alzheimers sjukdom Hongjun Fu 1,4 Gustavo A. Rodriguez 1,4 Mathieu Herman 1 Sheina Emrani 1 Eden Nahmani 1 Geoffrey Barrett 1 Helen Y Figueroa 1 Eliana Goldberg 1 S. Abid Hussaini 1,2,4,. Karen E. Duff 1,2,3,5,. 1 Taub-institutet för forskning om Alzheimers sjukdom och åldrande hjärnan, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, USA 2 Institutionen för patologi och cellbiologi, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, USA 3 Institutionen för integrerad neurovetenskap , New York State Psychiatric Institute, New York, NY 10032, USA mottagen den 20 juli 2016. Reviderad den 20 oktober 2016. Godkänd den 15 december 2016. Tillgänglig online den 19 januari 2017. Publicerad: 19 januari 2017 Höjdpunkter Tau-patologi inducerar rumsminneunderskott i gamla , men inte unga, EC-Tau-möss. Åldrade EC-Tau-möss uppvisar gridcellhypoaktivitet och reducerad periodicitet. Excitatoriska, men inte inhiberande, MEC-neuroner är sårbara för tau-patologi. Ändrad neuronaktivitet korrelerar med neurodegenerering i gammal EC-Tau. De tidigaste stadierna av Alzheimers sjukdom (AD) kännetecknas av bildandet av mogna tarmar i entorhinal cortex och desorientering och förvirring när man navigerar på kända platser. Medial entorhinal cortex (MEC) innehåller specialiserade neuroner som heter gridceller som ingår i det rumsliga navigationssystemet. Här visar vi i en transgen musmodell som uttrycker mutant mänsklig tau framförallt i EG att bildandet av mogna tänglar i gamla möss var associerad med excitatorisk cellförlust och underskott i nätcellsfunktionen, inklusive destabiliserade nätfält och reducerade avfyringshastigheter, såväl som förändrad nätverksaktivitet. Overt-tau-patologi hos de åldrade mössen åtföljdes av rumsminneunderskott. Därför kan tau-patologi initierad i entorhinal cortex leda till underskott vid gallcellsavbrott och ligga till grund för försämringen av rumslig kognition som ses i human AD. tau patologi Alzheimers sjukdom entorhinal cortex rutnät celler neuronal förlust kognitiva underskott neurofibrillära tangles rumsligt minne elektrofysiologi hypoaktivitet Figur 1. Figur 2. Figur 3. Figur 4.November 04, 2010 Följande information är en uppdaterad version av en metod för att använda ImageJ för att analysera western blottar från en nu avstängd äldre sida. Om you8217re söker ett mer omfattande arbetsflödesalternativ för dina western blot-analyser, besök min handledning om hur du använder Image Studio Lite. ett gratis mjukvarupaket från LI-COR Biosciences. Programmet Studio Studio Lite kan laddas ner gratis från licorislite. Förutom funktionaliteten som beskrivs nedan för ImageJ, erbjuder Image Studio Lite ytterligare datahanteringsfunktioner tillsammans med anteckningsverktyg för att producera publiceringsbilder från dina westerns. ImageJ (rsb. info. nih. govijindex. html) kan användas för att jämföra densiteten (aka intensitet) av band på en agargel eller western blot. Denna handledning förutsätter att du har tagit din gel eller blott genom visualiseringssteget, så att du har en digital bild av din gel i. tif. jpg. png eller andra bildformat (en 16-bit. tif skulle vara det föredragna formatet för att behålla den maximala informationen i originalbilden). Om du skannar röntgenfilm på en flatbäddscanner, se till att du använder en skanner med möjlighet att skanna OH-film (dvs. film) och använda skannerns programvara för att spara 16-bitars TIFF-bilder. Se referenserna i slutet av denna handledning för en diskussion av de olika sätten att du kan skruva upp detta steg. Detta förutsätter också att du inte överskattade din blotta bild när du producerade den. För en förklaring till varför överexponering förstör dina resultat, se den här sidan. Metoden som beskrivs här använder Gel Analysis-metoden som beskrivs i ImageJ-dokumentationen: Gel-analys. Du kanske föredrar att använda den istället för de metoder jag skisserar nedan. Det bör finnas mycket liten skillnad mellan resultaten från de olika metoderna. Denna version av handledningen skapades med hjälp av ImageJ 1.42q på en Windows 7 64-bitars installation. 1. Öppna bildfilen med FilegtOpen i ImageJ. 2. Gelanalysrutinen kräver att bilden ska vara en gråskalig bild. Den enklaste metoden att konvertera till gråskala är att gå till ImagegtTypegt8-bit. Din bild ska se ut som Figur 1. Figur 1. En tillverkad western blot-bild öppnad i ImageJ. Informationen längst upp på bilden visar att bilden för närvarande är i 8-bitars läge, med hjälp av en inverterad LUT (look-up-tabell). Den inverterande LUT säkerställer att mörka band registreras som högre densitetsvärden. 3. Välj verktyget Rektangulärt val från verktygsfältet ImageJ. Rita en rektangel runt den första körfältet. ImageJ förutsätter att dina banor löper vertikalt (så enskilda band är horisontella), så din rektangel ska vara lång och smal för att bifoga en enda lane. Om du ritar en rektangel som är kort och bred, kommer ImageJ att byta till att banorna körs horisontellt (enskilda band är vertikala) vilket leder till mycket förvirring. Figur 2. Den första körfältet har valts med verktyget Rectangular Selections 4. Efter att du har ritat rektangeln över din första körfält, trycker du på tangenten 1 (Kommando 1 på Mac) (Kommando 1 på Mac) eller går till AnalyzegtGelsgtSelect First Lane för att ställa in rektangel på plats. Den första lane kommer nu att markeras och ha en 1 i mitten av den. 5. Använd musen för att klicka och hålla i mitten av rektangeln på 1: a lane och dra över den till nästa lane. Du kan också använda piltangenterna för att flytta rektangeln, men det här är långsammare. Centrera rektangeln över banan vänster-till-höger, men don8217t oroa dig om att du gör det perfekt på samma vertikala axel. Image-J justerar automatiskt rektangeln på samma vertikala axel som den första rektangeln i nästa steg. 6. Tryck på 2 (Command 2 på Mac) eller gå till AnalyzegtGelsgtSelect Next Lane för att ställa in rektangeln på plats över den andra körfältet. A 2 kommer att dyka upp i banan när rektangeln är placerad. 7. Repetera steg 5 6 för varje efterföljande bana på gelén, tryck på 2 (Command 2 på Mac) varje gång för att ställa in rektangeln på plats (Figur 3). Figur 3. Placera rektangeln över varje körfält, tryck 2 varje gång för att ställa in rektangeln på plats. 8. När du har satt rektangeln på plats på sista körfältet (genom att trycka 2) trycker du på 3 (Kommando 3 på Mac), eller går till AnalyzegtGelsgtPlot Körfält för att rita en profilbild av varje körfält. Figur 4. Profilbilden från exemplet western blot. 9. Profilbilden representerar den relativa densiteten av rektangelns innehåll över varje lane. Rektanglarna är ordnade upp till botten på profilbilden. I exemplet western blot-bilden motsvarar topparna i profilbilden (Figur 4) de mörka banden i originalbilden (Figur 3). Eftersom det fanns fyra banor valda, finns det fyra sektioner i profilbilden. Högre toppar representerar mörkare band. Bredare toppar representerar band som täcker ett större storlek på originalgelén. 10. Bilder av riktiga geler eller västerländska blottar kommer alltid att ha en viss bakgrundssignal, så topparna don8217t når ner till grundlinjen för profilplanen. Figur 5 visar en topp från en verklig blotta där det fanns något bakgrundsbrus, så toppen verkar flyta över baslinjen av profilbilden. Det kommer att bli nödvändigt att stänga toppen så att vi kan mäta dess storlek. Figur 5. Real western blots har ofta lite bakgrundsbrus, så toppen går inte ner till baslinjen (perfekt vit). 11. Välj verktyget Straight Line-valet från verktygsfältet ImageJ (Figur 6). För varje topp som du vill analysera i profilbilden, rita en linje över toppen av toppen för att omsluta toppen (figur 5). Detta steg kräver viss subjektiv bedömning från din sida för att bestämma var toppen slutar och bakgrundsbruset börjar. Figur 6. Använd raklinjeverktyget för att stänga basen av varje topp av intresse. Figur 7. Toppen från figur 5 är visad med en linje tagen över toppen av toppen för att omsluta toppens yta. 12. Observera att om du har många körfält markerade, kommer de senare körfältna att döljas längst ner i profilfönstret. För att se dessa banor, tryck och håll ned mellanslagstangenten och använd musen för att klicka och dra profilprofilen uppåt. 13. När varje topp har stängts av vid basen med verktyget Straight Line väljer du Wand-verktyget från verktygsfältet ImageJ (Figur 8). Figur 8. Välj Wand-verktyget för att markera varje topp av intresse på profilbilden. 14. Använd mellanslagstangenten och musen genom att dra profilprofilen nedåt tills du är tillbaka vid första körfältet. Med Wand-verktyget klickar du inuti toppen (Figur 9). Upprepa detta för varje topp när du går ner i profilen. För varje topp som du markerar ska mätningar dyka upp i fönstret Resultat som visas. Figur 9. Klicka inuti den 1: a toppen av intresse med Wand-verktyget. Toppen ska markeras och en mätning ska dyka upp i fönstret Resultat. 15. När alla topparna har blivit markerade, gå till AnalyzegtGelsgtLabel Peaks. Detta märker varje topp med sin storlek, uttryckt som en procentandel av den totala storleken på alla de markerade topparna. 16. Värdena i resultatfönstret (Figur 10) kan flyttas till ett kalkylprogram genom att välja Redigera kopiera alla i fönstret Resultat. Klistra in värdena i ett kalkylblad. Figur 10. Utgången från att välja toppar i profilbilden och märka topparna. I det här fallet är resultaten från att välja det övre bandet i var och en av de 4 banorna i exemplet Western blot från Figur 1. Obs! Om du av misstag klickar på fel plats med Wand. Programmet registrerar fortfarande det klickade området som en topp, och det kommer att faktor i det totala areal som används för att beräkna procentvärdena. Självklart kommer detta att skingra dina resultat om du klickar på områden som aren8217t toppar. Om du råkar klicka på fel plats går du enkelt till AnalyzegtGelgtLabel Peaks för att plotta de aktuella resultaten, som visar felaktiga värden, men återställer räknaren för resultatresultatet ännu viktigare. Gå tillbaka till profilens plot och börja klicka inuti topparna igen, från och med den 1: a toppen av intresse. Fönstret Resultat ska rensa och börja visa dina nya värden. När du är säker på att du klickar på alla de korrekta toppar utan att du slumpvis klickar på några felaktiga områden kan du gå tillbaka till AnalyzegtGelsgtLabel Peaks och få rätt resultat. Dataanalys Med dina data klistrade in i ett kalkylblad kan du nu beräkna den relativa densiteten hos topparna. Som en påminnelse är de värden som beräknas av ImageJ väsentligen godtyckliga tal, de har bara mening inom ramen för uppsättningen toppar som du valt på den enda gelbilden du har arbetat på. De har inte enheter av g protein eller några andra verkliga enheter som du kan tänka dig. Det normala förfarandet är att uttrycka densiteten hos de valda band i förhållande till vissa standardband som du också valt under denna process. 1. Placera dina data i ett kalkylblad. En av topparna bör vara din standard. I detta exempel använder vi8217ll den 1: a topp som standard. 2. I en ny kolumn bredvid kolumnen Procentdela dela procentvärdet för varje prov med procentvärdet för standarden (den första toppen i det här fallet, 26.666). 3. Den resulterande kolonnen av värden är ett mått på den relativa densiteten hos varje topp jämfört med standarden, som uppenbarligen har en relativ densitet av 1. Figur 11. Beräkning av relativ densitet för var och en av de 4 markerade topparna. Vi använder prov 1 som standard för denna gel. Relativ densitet beräknas genom att dividera procentvärdet för varje prov med procentvärdet för standarden. 4. I det här exemplet har den andra banan en högre relativ densitet (1,86), vilket väl motsvarar storleken och mörkret i det bandet i den ursprungliga bilden (figur 1). Kom ihåg att dessa data är för den övre raden av band på den ursprungliga western blot-bilden. 5. Om du vill jämföra tätheten av prover på flera geler eller fläckar måste du använda samma standardprov på varje gel för att ge en gemensam referens när du beräknar Relativa Densitetsvärden. Se avsnittet nedan för en detaljerad diskussion av dessa krav. 6. För att testa för signifikanta skillnader mellan behandlingar i ett experiment måste alla dina geler eller blottar skannas och kvantifieras med hjälp av denna metod och värdena kommer att uttryckas i relativ densitet eller du kan behandla relativ densitet som ett vikningsförändringsvärde (dvs. en relativ densitetsskillnad på 2 mellan en kontroll och en behandling skulle indikera en tvåfaldig förändring i uttryck). Om du använder analys av variationstekniker för att testa dina data, kan du behöva se till att dina relativa densitetsvärden normalt fördelas och att det finns homogenitet av variation bland de olika behandlingarna. 7. Det bör noteras här att vissa forskare gör extra insats för att inkludera en uppsättning serieutspädningar av en känd standard på varje blöt. Med användning av serieutspädningskurvan och kvantifieringsmetoderna som beskrivits ovan bör det vara möjligt att uttrycka dina provband i form av picogram eller nanogram protein. Ett mer inblandat exempel med hjälp av lastkontroll. We8217ll använder figur 12 som en representativ western blot. På den här fläcken kommer vi att låtsas att vi laddade fyra replikatprover av protein (fyra pipettbelastningar ur samma flaska homogenat), så vi förväntar oss att densiteterna i varje lane är likvärdiga. Den övre raden av staplar representerar vårt protein av intresse. Den nedre satsen av staplar representerar vårt laddningsprotein, vilket är avsett att säkerställa att en lika mängd totalt protein laddades i varje körfält. Detta laddnings-kontrollprotein är ett protein som antagligen uttrycks på en konstant nivå oavsett behandling som appliceras på de ursprungliga organismerna, såsom aktin (även om många kommer ifrågasätta påståendet att aktin kommer att uttryckas likvärdigt över behandlingar). Figur 12. Ett exempel på västra blott med en nedre rad av laststyrningsband. Ofta representerar dessa band ett protein som antas uttryckas likvärdigt i alla behandlingar, såsom aktin. Med tanke på Figur 12 hade vi hoppats att läsa in motsvarande mängder totalt protein i varje körfält, men efter att ha kört den västra blottet varierar storleken och intensiteten hos de nedre stavarna i varje körfält ganska mycket. De två vänstra körfälten är likvärdiga, men den tredje körfältet har halva densiteten (grått värde) jämfört med körfält 12, medan körfält 4 har halva densiteten och halva storleken jämfört med körfält 12. Eftersom våra lastkontroller är så olika, värden på den övre uppsättningen band kanske inte är direkt jämförbara. We8217ll använder ImageJ8217s gelanalysrutin för att kvantifiera tjocklekens storlek och storlek och använda resultaten från våra belastningsreglage (lägre band) för att skala värdena för vårt protein av intresse (övre band). 1. Öppna western blot-bilden i ImageJ. 2. Se till att bilden är i 8-bitarsläge: gå till ImagegtTypegt8-bit. 3. Använd rektangulärverktyget för att rita en ruta runt hela 1: a lane (både övre och nedre staplarna ingår. 4. Tryck på 822018221 (eller Kommando 1 på Mac) för att ställa in rektangeln. A 822018221 ska visas mitt i rektangeln. 5. Klicka och håll i mitten av rektangeln och dra den över den andra körfältet. 6. Tryck på 822028221 (Command 2 på Mac) för att ställa in rektangeln för körfält 2. A 822028221 ska visas i mitten av rektangeln. Upprepa steg 5 6 för varje efterföljande körfält, tryck 822028221 (Command 2 på Mac) för att ställa in rektangeln över varje efterföljande körfält (se Figur 13). Figur 13. Varje körfält har valts genom att flytta rektangeln över det och trycka på 822028221 för att ställa in rektangeln på plats. 8. När du har lagt den sista körfältet (och tryckt på 822028221 för att ställa in det) kan du trycka 822038221 för att skapa en plot av de valda banorna (se figur 14). Figur 14. Profil av varje körfält (arrangerad med körfält 1 längst upp, körfält 4 längst ner). Du kan behöva bläddra igenom t han fönster för att se alla banor. 9. Profilprofilen representerar i huvudsak medeltäthetsvärdet över en uppsättning horisontella skivor av varje bana. Mörkare blottar kommer att ha högre toppar, och blottar som täcker ett större storlekar (kD) kommer att ha bredare toppar. I vårt exempel western blot är banden perfekta rektanglar, men du kommer att märka en viss sluttning i profilplottstopparna, eftersom ImageJ applicerar lite medelvärde för densitetsvärden när det rör sig från topp till botten av varje lane. As a result, the sharp transition from perfect white to perfect black on the bands of lane 1 is translated into a slight slope on the profile plot due to the averaging. 10. On our idealized western blot used here, there is no background noise, so the peak reaches all the way down to the baseline of the profile plot. In real western blots, there will be some background noise (the background will not be perfectly white), so the peaks won8217t reach the baseline of the profile plot (see figure 5 above). As a result, each plot will need to have a line drawn across the base of the peak to close it off. 11. Choose the Straight Line selection tool from the ImageJ toolbar. For each peak you want to analyze in the profile plot, draw a line across the base of the peak to enclose the peak (Figure 7). This step requires some subjective judgment on your part to decide where the peak ends and the background noise begins. 12. When each peak of interest is closed off with the straight line tool, switch to the Wand tool. We will use the wand tool to highlight each peak of interest so that Image-J can calculate its relative areadensity. 13. We will start by highlighting the loading-control bands (lower row) on our example western blot. Beginning at the top of the profile plot, use the wand to click inside the 1st peak (Figure 15). The peak should be highlighted after you click on it. Continue clicking on the loading-control peaks for the other lanes. If a lane is not visible at the bottom of the profile plot, hold down the space bar and click-and-drag the profile plot upwards to reveal the remaining lanes. Figure 15. Click inside the loading-control peak with the wand tool. Click on each of the loading-control peaks for the remaining lanes (ignore the protein lanes to the left for now). 14. When the loading control peak for each lane has been highlighted with the wand, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks. Each highlighted peak will be labeled with its relative size expressed as a percentage of the total area of all the highlighted peaks. You can go to the Results window and choose EditgtCopy All to copy the results for placement in a spreadsheet. Figure 16. Area and Percent values for our loading-control bands from the example western blot. Lanes 1 and 2 are equal, as we expect by looking at the original bands on the western blot (Figure 12). 15. Repeat steps 13 14 for the real sample peaks now. We are selecting these peaks separately from the loading-control peaks so that those areas are not factored into the calculation of the density of our proteins-of-interest. As before, use the Wand tool to click inside the area of the peak in the 1st lane, then continue clicking inside the peaks of the remaining lanes. When finished, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks to show the results. Copy the results to a spreadsheet alongside the data for the loading-control bands (Figure 17). Figure 17. Results from the loading-control bands (labeled 8220stds8221 here) and the sample protein peaks (the upper row of bands on the original western blot). Data Analysis with loading-control bands 1. With all of the relative density values now in the spreadsheet, we can calculate the relative amounts of protein on the western blot. Remember that the 8220Area8221 and 8220Percent8221 values returned by ImageJ are expressed as relative values, based only on the peaks that you highlighted on the gel. Start the analysis by calculating Relative Density values for each of the loading-standard bands. In this case, we8217ll pretend that Lane 1 is our control that we want to compare the other 3 lanes to. Divide the Percent value for each lane by the Percent value in the control (Lane 1 here) to get a set of density values that is relative to the amount of protein in Lane 18217s loading-control band (Figure 18). Figure 18. Calculate Relative Density values by dividing the Percent values in each row by the control sample8217s Percent value (Lane 1, 40.828, in our example). 2. Next we8217ll calculate the Relative Density values for our sample protein bands (upper row on the example western blot). We carry out a similar calculation as step 1, dividing the Percent value in each row by the Percent value of our control8217s protein band (Lane 1 here). Figure 19. Calculate Relative Density values for the Samples as well, using the Percent value for your control protein band (Lane 1, 40.585 here). Note: Recall that because some of our loading-control bands were wildly different on the original western blot, we can8217t simply use the Relative Density values from our Samples calculated in Step 2 as the final results. Now it is necessary to scale the Relative Density values for the Samples by the Relative Density of the corresponding loading-control bands for each lane. We do this based on the assumption that the proportional differences in the Relative Densities of the loading-control bands represent the proportional differences in amounts of total protein we loaded on the gel. In our example western blot, we have evidence of massively different amounts of total protein in each sample (poor pipetting practice, probably). 3. The final step is to scale our Sample Relative Densities using the Relative Densities of the loading-controls. On the spreadsheet, divide the Sample Relative Density of each lane by the loading-control Relative Density for that same lane. Figure 20. Adjusted Density values (yellow cells) for our samples were calculated by dividing the Relative Density of each Sample lane by the Relative Density of the loading-control for the same lane. For example, the Relative Density for Sample 4 (0.1628) was divided by the Relative Density for the loading-control in Lane 4 (0.154379) to get an Adjusted Density value of 1.054. 4. When we created our imaginary example western blot, we expected to get equivalent amounts of the protein of interest in each lane, because we (hypothetically) loaded equivalent sample volumes of protein from the same vial of homogenate in each lane. During the loading process, something went awry, and we got very different densities on the western blot. But after carrying out the loading-control corrections above, we find that our Adjusted Densities for each of the 4 lanes are roughly equivalent (all are approximately 1), indicating that there are equivalent ratios of the protein of interest contained within the sample of total protein in each lane, as we would expect. The example above represents a special case. In reality, you will typically be skilled enough to pipette equivalent amounts of total protein into your gel lanes, presumably because you have used a process like the BCA Protein Assay to quantify the total amount of protein present in each of your homogenate samples. This can obviate the need for the loading-control bands and the associated controversy about whether the protein you8217re using to assess equal loading is truly expressed consistently across all treatment levels. Extending the example to multiple western blots If you can apply equal amounts of total protein to each lane of a gel, then you only need to concern yourself with having an appropriate standard sample placed on each western blot you run for the project. For example, you might purchase an aliquot of purified Human Hsp70 and place 1l in a lane on each gel you run when probing for Hsp70. Or you might save some money by creating your own standard sample by mixing aliquots of several of your homogenates to make a large quantity of mixed homogenate that you can use to load a standard volume onto a single lane of each gel for your entire project (running out of this mixture part way through your project would be a Bad Thing). In this case you may not know the true concentration of the protein of interest in your mixed homogenate, but you will at least be able to get an equivalent amount of total protein (including the protein of interest) on each gel. The goal of the standard sample is to account for variations in antibody binding efficiency (for example if you8217re re-using a mixture of antibody on multiple western blots to save money), for variations in blocking and washing efficiency, for variation in the decay rate of a chemiluminescent reagent used to visualize the antibodies, or for variation in the exposure time of your x-ray film. In any of these cases, the intensity of the signal you get out of your western blot can vary from blot to blot (Figure 21). You can use a standard sample on each gel to normalize every other band on that same blot, and then compare across multiple blots because every band in your dataset is normalized to the same standard (be it 10ng of Human Hsp70 or a mixture of several homogenates). Figure 21. Two example western blots with a common standard sample (Lane 1). The bindingincubationdevelopment steps of these two blots varied slightly, resulting in a different final exposure which alters the absolute densities on the two blots. Because we have a standard sample on both blots, which is an identical volume of an identical protein sample (i. e. drawn from a common aliquot of homogenate), we can express the densities of the other lanes on each gel relative to the standard sample, eliminating the effects of the differing exposures. Finally, if you are using a loading-control protein band (lower row on these blots) on each gel, and a standard protein sample on multiple gels, you can correct both for differences in total protein loaded in a lane (using the loading-control band) and for differences in exposure between gels (using the standard sample). For example, consider the two gels in Figure 21. The 1st (white) gel has minimal background noise, and there is some variation the amount of protein loaded in each lane, as revealed by the size and density of the loading control bands of the samples. The 1st lane on the left is our standard sample used on each gel. The 2nd (gray) gel has more background noise due to a different exposure time, poor washing, or any number of possible problems. Again, there are different protein quantities loaded in the 4 lanes, based on the size and density of the loading-control bands on the lower half. The 1st lane on the left is the same standard protein sample as that used on the 1st gel. We would start by analyzing the two gels separately, using the protocol in the loading-control portion of this document. 1. Calculate the relative density of the loading-control bands (lower row on this gel). Use the loading-control band for the standard in lane 1 to do this calculation. 2. Calculate the relative density of the bands for the protein band of interest (upper row on this gel). Use the protein band of interest for the standard in lane 1 to do this calculation. 3. Adjust the relative densities calculated in Step 2 using the relative densities for the loading-control bands calculated in Step 1. Simply divide the relative density from Step 2 for each lane by the corresponding relative density from Step 1. After you8217ve scaled the density of the protein of interest for each sample to the standard sample, and adjusted the relative density based on the loading-control band, you are left with an estimate of the relative density of the protein of interest in each lane on your gel (relative to the standard in lane 1). Repeat this for each separate gel. When finished, you8217ll note that because every sample lane is normalized to the standard sample in Lane 1 on that particular gel, and every gel contains the same standard sample, your cross-gel comparison is already accomplished, since every sample is now normalized to the same standard sample (Figure 22). Figure 22. Example data from two western blots. The Relative Densities of the loading-control bands (lower bands on each gel, red and yellow lines) was calculated, using the value for the standard in Lane 1 (lower band) on each gel. The Relative Densities for the sample bands (upper row on each gel, blue and green lines) were calculated separately, and were normalized relative to the standard in Lane 1 (upper band). The 8220Adjusted Density8221 for each sample lane was calculated by dividing the sample relative density by the loading-control relative density for each lane separately (i. e. for sample 3, 0.1857960.188449 0.98592). After all of this work, you8217re left with (adjusted) Relative Densities for each of your samples (the yellow cells in Figure 22). At this point you can ignore the values of the standard samples, since you only needed those to ensure that your cross-gel comparisons were scaled properly. Now you can finally begin calculating average relative density values for your experimental control samples (maybe these are samples 36) and your experimental treatment samples (perhaps these are samples 14 and 25) to carry out the real comparison of protein expression under your treatment conditions. Because your relative density values are all normalized to the standard sample, you may wish to eventually re-scale your relative density values once again using your experimental controls8217 average value as a baseline. A few extra details: With regard to the ImageJ gel analysis routine, there has been some question of what the values reported by ImageJ correspond to. The images below may help illustrate what Image-J is measuring. Figure 25. A comparison of 8220area8221 values returned by ImageJ. In Figure 25 above, I have drawn out a set of fake 8220bands8221 in Adobe Illustrator. The gray value and area of each band are listed above the band (in this case a lower pixel value darker band). Additionally, I have included the 8220area8221 value returned by Image-J after plotting the bands and clicking in each peak with the Wand tool. Note that these 8220area8221 values are a RELATIVE measure of the size and density of each peak you clicked with the wand tool. When you halve the area of a band, but maintain the same gray value (compare lanes 12), the value reported by ImageJ is half as large. By the same token, if you halve the gray value but maintain the same area (compare lanes 15), the value reported by Image-J is halved. Figure 26. Image-J will return similar area values when bands have equivalent numbers of pixels of equal darkness, but vary in shape. The same holds true for bands of different shapes. In Figure 26 above, altering the shape of the band, but maintaining the same gray value and area (compare lanes 13) yields an equivalent value from ImageJ. Figure 27. Image-J deals with gaps in bands just fine. Note however that the 8220area8221 values returned by ImageJ are different compared to Figure 26 and Figure 27, because the number of lanes, size of the bands, and density of the bands has changed. Image-J also accounts for gaps in a band, as shown in Figure 27 above. Compare lanes 13, which both have an equal number of gray pixels and equal gray values (i. e. equal amounts of protein on the gel). ImageJ reports the same 8220area8221 value for both of these lanes. It is worth reiterating that the 8220area8221 values and percentages reported by Image-J are always relative to the total size and density of bands that you have selected in a particular image. In the image immediately above (Figure 27), the band in column 1 returns an 8220area8221 value of 4000, while in the previous two images column 1 (Figs 25 26) had the same size band, but with twice the gray value, which in both cases also returned a value of 4000. The raw values returned by Image-J are meaningless for comparing across different gels, since they are only a relative measure of the bands you8217ve highlighted on a particular gel image. This is why we need to standardize to some common standard loaded onto all of the gels. Additional references 8211 The methods outlined here are by no means canonical and there are plenty of subtleties to be considered in this sort of analysis. For more practical considerations of scanning and analyzing gel images, see the following papers: Gassmann, M. Grenacher, B. Rohde, B. and Vogel, J. (2009). Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis 30, 1845-1855. doi: Tan, H. Y. and Ng, T. W. (2008). Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Optics Communications 281, 3013-3017. doi: You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. Both comments and pings are currently closed.